應(yīng)用方向
顯微高光譜成像系統(tǒng)被成功應(yīng)用于土壤中 Mycogone perniciosa（惡性傘殼霉）厚垣孢子的高精度檢測(cè)，為農(nóng)業(yè)病害早篩提供了技術(shù)支撐。該設(shè)備具備微米級(jí)空間分辨率與400–1000 nm連續(xù)光譜采集能力，可在無(wú)需染色或標(biāo)記的情況下識(shí)別微小病原體，極大提升了病害監(jiān)測(cè)的效率與準(zhǔn)確性。通過(guò)結(jié)合高光譜成像與AI算法（如Faster R-CNN等深度學(xué)習(xí)檢測(cè)模型），該系統(tǒng)能夠?qū)?fù)雜背景下的微小結(jié)構(gòu)進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別、目標(biāo)定位與類別判斷，克服傳統(tǒng)顯微鏡在識(shí)別精度和批量處理方面的局限。
背景
Mycogone perniciosa（惡性傘殼霉）是引起蘑菇畸形病的主要病原菌之一，屬于重要的土傳病原真菌。其在生產(chǎn)過(guò)程中具有*強(qiáng)的隱蔽性和傳播性，能夠長(zhǎng)期潛伏于土壤中，以休眠孢子的形式存在，一旦遇到適宜環(huán)境即迅速發(fā)病，對(duì)食用菌產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如顯微鏡人工識(shí)別和培養(yǎng)分離不僅操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、依賴經(jīng)驗(yàn)，且檢測(cè)靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的快速高效篩查。因此，亟需一種靈敏度高、效率高、自動(dòng)化程度強(qiáng)的新型檢測(cè)手段。
顯微高光譜成像（Hyperspectral Microscopic Imaging, HMI）作為融合圖像空間信息與光譜信息的先進(jìn)技術(shù)，具備非接觸、高分辨率、無(wú)染料標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品安全和農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害檢測(cè)等領(lǐng)域。其在土壤樣本中對(duì)微小目標(biāo)物（如孢子）的高精度識(shí)別方面展現(xiàn)出巨大潛力。結(jié)合深度學(xué)習(xí)模型進(jìn)行圖像智能識(shí)別與分類，有望打破傳統(tǒng)識(shí)別技術(shù)的瓶頸，為土壤中Mycogone perniciosa孢子的早期、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供有效解決方案。
作者信息：介鄧飛，福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，碩士生導(dǎo)師
期刊來(lái)源：European Journal of Agronomy
研究?jī)?nèi)容
本研究旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中惡性傘殼霉厚垣孢子的快速、自動(dòng)化檢測(cè)，解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法效率低、誤判率高、依賴人工經(jīng)驗(yàn)等問(wèn)題。為此，作者提出了一種結(jié)合顯微高光譜成像技術(shù)（HMI）與改進(jìn)型深度學(xué)習(xí)檢測(cè)模型的孢子識(shí)別方法。研究首先利用高光譜顯微系統(tǒng)對(duì)土壤樣本中目標(biāo)孢子進(jìn)行成像，獲取融合空間與光譜信息的圖像數(shù)據(jù)；接著，通過(guò)主成分分析（PCA）降維處理，提取具有代表性的高光譜偽彩圖像。在模型構(gòu)建方面，基于YOLOv5網(wǎng)絡(luò)框架進(jìn)行改進(jìn)：引入輕量級(jí)注意力機(jī)制（CA模塊）增強(qiáng)特征表達(dá)能力，融合BiFPN結(jié)構(gòu)提升多尺度目標(biāo)檢測(cè)效果，并使用CIoU損失函數(shù)優(yōu)化邊界框回歸性能。改進(jìn)模型可對(duì)輸入圖像中孢子目標(biāo)進(jìn)行高效檢測(cè)與識(shí)別。所提方法在檢測(cè)精度、召回率及推理速度等方面均優(yōu)于原始YOLOv5模型，有效提升了土壤中孢子的檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
本研究所用的Mycogone perniciosa厚垣孢子來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的病原菌株。首先將其接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，獲得大量孢子。然后將培養(yǎng)皿表面形成的孢子輕輕刮取并置入1 mL無(wú)菌水中，充分震蕩混勻，形成孢子懸浮液。再向每個(gè)處理組土壤中分別加入適量的孢子懸浮液，使其混合均勻。隨后將土壤樣品取出放置在載玻片上，并在自然光下進(jìn)行空氣干燥，以備后續(xù)成像實(shí)驗(yàn)。
本研究采用由光學(xué)顯微鏡（BX53，Olympus）與高光譜成像系統(tǒng)（GaiaField Pro-V10E，江蘇雙利合譜科技有限公司）組成的顯微高光譜成像系統(tǒng)（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。該系統(tǒng)通過(guò)無(wú)線傳輸模塊與計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)圖像采集控制，其光譜范圍為400-1000 nm，光譜分辨率為2.8 nm。為適配厚垣孢子尺寸，顯微鏡配置10倍物鏡（目鏡1×，物鏡10×）進(jìn)行觀測(cè)，高光譜相機(jī)曝光時(shí)間設(shè)置為7.9 ms。系統(tǒng)空間檢測(cè)像素為960，光譜成像波段176個(gè)，每次掃描890行，因此高光譜圖像維度為960×890×176。本研究共計(jì)采集1023幅有效圖像。
圖1. 顯微高光譜成像系統(tǒng)
研究方法
由于環(huán)境噪聲以及系統(tǒng)光源、光路元件、傳感器等性能的影響，顯微高光譜成像系統(tǒng)獲取的原始圖像數(shù)據(jù)不可避免地包含各種干擾，原始顯微高光譜圖像在不同的光譜波段上表現(xiàn)出不同的信息含量，為了獲得高信息含量的圖像波段，剔除了異常譜帶，保留了430 -720 nm范圍內(nèi)的91個(gè)譜帶，以供進(jìn)一步研究。之后使用黑白校準(zhǔn)算法對(duì)采集的圖像進(jìn)行去噪和輻射校正，提高成像質(zhì)量。針對(duì)高光譜圖像數(shù)據(jù)量大、數(shù)據(jù)冗余和多重共線性等問(wèn)題，采用主成分分析（PCA）方法將高維數(shù)據(jù)投影到低維數(shù)據(jù)上，通過(guò)主成分分析（PCA）降維，前三個(gè)主成分（PC1、PC2和PC3）包含了95%以上的信息，因此選擇這三個(gè)主成分作為厚垣孢子檢測(cè)模型的輸入。
針對(duì)傳統(tǒng)Faster R-CNN在小目標(biāo)檢測(cè)中特征提取能力不足、潛在特征信息易丟失等問(wèn)題，本研究提出了一種基于改進(jìn)Faster R-CNN（Resnet50-FPN）的M. perniciosa厚垣孢子檢測(cè)方法。該改進(jìn)模型通過(guò)將殘差網(wǎng)絡(luò)Resnet50與特征金字塔網(wǎng)絡(luò)（FPN）集成到區(qū)域提議網(wǎng)絡(luò)（RPN）和區(qū)域卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（R-CNN）中，有效提升了厚垣孢子特征提取能力。圖2展示了厚垣孢子目標(biāo)的完整檢測(cè)流程圖。該改進(jìn)方法通過(guò)多層次特征融合與多尺度檢測(cè)策略，顯著提升了微小孢子目標(biāo)的檢測(cè)精度。此外，為適應(yīng)高光譜圖像的特性，研究對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了輕量化處理，減少參數(shù)量與計(jì)算開(kāi)銷，同時(shí)提升檢測(cè)速度和效率。通過(guò)這些改進(jìn)，模型在保持高檢測(cè)精度的同時(shí)兼顧了運(yùn)行效率，適合在顯微圖像中進(jìn)行小尺度目標(biāo)檢測(cè)任務(wù)。
圖2. 惡性毛殼菌厚垣孢子目標(biāo)檢測(cè)的流程圖。
在進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)標(biāo)注時(shí)，準(zhǔn)確區(qū)分厚垣孢子與雜質(zhì)顆粒是關(guān)鍵步驟。如圖3(a)所示，通過(guò)顯微圖像對(duì)比可清晰觀察到：厚垣孢子通常呈現(xiàn)半透明的規(guī)則圓形結(jié)構(gòu)（直徑約5-10μm），而雜質(zhì)顆粒則多表現(xiàn)為透明度較低的不規(guī)則形態(tài)（如箭頭所示）。這種顯著的形態(tài)學(xué)差異為人工標(biāo)注提供了可靠的判別依據(jù)。
研究以高光譜圖像立方體為基礎(chǔ)，通過(guò)主成分分析（PCA）方法提取前三個(gè)主成分，將其構(gòu)建為偽彩色圖像，用于網(wǎng)絡(luò)輸入。然后，研究人員采用手工標(biāo)注方式對(duì)孢子目標(biāo)進(jìn)行邊界框標(biāo)記，將數(shù)據(jù)集按9：1的比例分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，訓(xùn)練過(guò)程中再按8：2的比例將訓(xùn)練集進(jìn)一步分成訓(xùn)練集和測(cè)試集進(jìn)行模型訓(xùn)練和驗(yàn)證。為了全面衡量目標(biāo)檢測(cè)效果，本文采用了Precision（精確率）、Recall（召回率）、平均查準(zhǔn)率（AP）作為評(píng)價(jià)模型性能的指標(biāo)。IOU度量預(yù)測(cè)框和目標(biāo)框之間的重疊。網(wǎng)絡(luò)模型通常會(huì)設(shè)置一個(gè)閾值，如果IOU超過(guò)閾值，則認(rèn)為預(yù)測(cè)框是正確的。該研究將IOU閾值設(shè)置為0.5。
在改進(jìn)的 Faster R-CNN 模型中，主要包括兩個(gè)損失函數(shù)部分，分別對(duì)應(yīng)于區(qū)域提議網(wǎng)絡(luò)（RPN）和全連接層。每個(gè)部分都包括分類損失和回歸損失。首先，在區(qū)域提議網(wǎng)絡(luò)（RPN）中：分類損失使用交叉熵?fù)p失（Cross Entropy Loss）函數(shù)，用于判斷錨框（anchor）是否包含目標(biāo)；回歸損失則采用平滑 L1 損失（Smooth L1 Loss）函數(shù)，衡量預(yù)測(cè)邊界框與真實(shí)框之間的位置差異。其次，在 RoI（Region of Interest）全連接層部分：同樣使用交叉熵?fù)p失進(jìn)行分類；并繼續(xù)使用平滑 L1 損失對(duì)邊界框坐標(biāo)進(jìn)行回歸優(yōu)化。這些損失函數(shù)共同構(gòu)成了模型的總損失函數(shù)，指導(dǎo)整個(gè)檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練過(guò)程中不斷優(yōu)化其分類準(zhǔn)確率和定位精度。通過(guò)聯(lián)合優(yōu)化分類與回歸任務(wù)，模型能夠更有效地學(xué)習(xí)到孢子在高光譜圖像中的空間位置與類別特征，從而提高整體檢測(cè)性能。
結(jié)果
在本研究中，F(xiàn)aster R-CNN模型分別采用了VGG16、Resnet50以及Resnet50-FPN作為特征提取網(wǎng)絡(luò)。此外，YOLOv3模型作為一種典型的單階段目標(biāo)檢測(cè)算法，被用作對(duì)比模型。表1展示了改進(jìn)型Faster R-CNN模型與其他模型在訓(xùn)練和測(cè)試過(guò)程中的消融研究結(jié)果。表1中的數(shù)據(jù)顯示，以Resnet50-FPN作為特征提取網(wǎng)絡(luò)的Faster R-CNN模型，無(wú)論輸入是主成分（PC）圖像還是RGB圖像，其平均精度（AP）@0.5均高于基于VGG16和Resnet50的Faster R-CNN模型。具體而言，當(dāng)以PC圖像作為模型輸入時(shí)，基于Resnet50-FPN的Faster R-CNN模型的AP值分別比以VGG16和Resnet50為骨干網(wǎng)絡(luò)的原始Faster R-CNN模型高出5.41%和4.78%。而當(dāng)以RGB圖像數(shù)據(jù)集作為模型輸入時(shí)，采用Resnet50-FPN作為特征提取網(wǎng)絡(luò)時(shí)，AP值分別比VGG16和Resnet50高出5.46%和2%。
本研究采用103幅顯微高光譜圖像，對(duì)配置五種PRN錨框尺度的Restnet50-FPN模型進(jìn)行了厚垣孢子實(shí)際檢測(cè)性能測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)表明：（1）圖3(a)-(d)顯示該模型能成功檢測(cè)厚垣孢子，驗(yàn)證了所提方法對(duì)小目標(biāo)檢測(cè)的有效性；（2）圖3(e)表明當(dāng)孢子存在堆疊現(xiàn)象時(shí)，模型會(huì)出現(xiàn)重復(fù)識(shí)別，檢測(cè)準(zhǔn)確率從非堆疊狀態(tài)的99%降至64%，這主要由于孢子堆疊導(dǎo)致其完整結(jié)構(gòu)被遮擋；（3）圖3(f)顯示仍存在誤檢和漏檢現(xiàn)象，這是因?yàn)楸狙芯繛楸苊馐褂没瘜W(xué)試劑而未進(jìn)行染色處理，導(dǎo)致背景中其他真菌殘留或雜質(zhì)與厚垣孢子在顏色和紋理上具有相似性。
圖3. 基于Resnet50-FPN改進(jìn)的Faster R-CNN模型的識(shí)別結(jié)果：(a)-(d) 正確識(shí)別；(e) 展示了由于厚垣孢子重疊，檢測(cè)模型產(chǎn)生了重復(fù)識(shí)別的情況；(f) 顯示了厚垣孢子的誤檢和漏檢情況。
結(jié)論
本研究采用顯微高光譜成像技術(shù)，用于在雙孢菇栽培過(guò)程中檢測(cè)土壤中的惡性毛殼菌厚垣孢子。惡性毛殼菌厚垣孢子的頻繁檢出表明雙孢菇感染該病害的風(fēng)險(xiǎn)較高?；陲@微高光譜圖像，提出了改進(jìn)型的Faster R-CNN模型，該模型結(jié)合了殘差網(wǎng)絡(luò)Resnet50和特征金字塔網(wǎng)絡(luò)（FPN），并對(duì)區(qū)域建議網(wǎng)絡(luò)（RPN）的錨點(diǎn)尺度進(jìn)行了優(yōu)化。這一方法在小目標(biāo)檢測(cè)方面表現(xiàn)出色，能夠識(shí)別出大部分的厚垣孢子。該研究為雙孢菇生產(chǎn)中惡性毛殼菌的早期檢測(cè)提供了一種創(chuàng)新方法。
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